铜绿丽金龟对植物源挥发物的触角电位和行为反应

谢明惠^1,2, 陈浩梁², 衣建坤¹, 李克斌¹, 张杰¹, 苏卫华^2*

(1. 中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193；

2. 安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所，合肥 230031）

摘要：为筛选适宜的铜绿丽金龟植物源引诱剂，利用触角电位（EAG）和“Y”型嗅觉仪技术，测定了铜绿丽金龟雌、雄虫对20种植物源挥发物的电生理和行为反应。结果表明：在10μg/μL浓度下，铜绿丽金龟对甲基庚烯酮、顺-3-己酰乙酸酯、壬醛、1-辛烯-3-醇、芳樟醇和反-2-己烯醇具有较强的触角电位反应，且呈雌虫大于雄虫的趋势。Y型嗅觉仪行为测定中，雌虫对多数挥发物的敏感度高于雄虫。其中反-2-己烯醇、顺-3-己酰乙酸酯、甲基庚烯酮和1-辛烯-3-醇对铜绿丽金龟雌虫的吸引作用显著高于对照；而雄虫仅对顺-3-己酰乙酸酯有显著的趋向选择。本研究为开发有效的铜绿丽金龟田间引诱剂用于生态治理提供理论依据。

关键词：铜绿丽金龟；植物源挥发物；Y型嗅觉仪；触角电位技术；行为反应

中图分类号：Q965   文献标识号：A

Electroantennographic and behavioral responses of

 Anomala corpulenta to plant volatiles

Xie Minghui^1,2, Chen Haoliang², Yi Jiankun¹, Li Kebin¹, Zhang Jie¹, Su Weihua²

(1. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China; 2. Institute of Plant Protection and Agro-products Safety, Anhui Academy of Agricultural Sciences, Hefei 230031, China)

Abstract: To find the possible attractants, twenty kinds of plant volatiles were chosen for electroantennogram test and Y-tube olfactometer bioassays on both female and male Anomala corpulenta. The results showed that methyl heptenone, cis-3-hexanoyl acetate, nonanal, 1-octene-3-alcohol, linalool and trans-2-hexenol elicited significant EAG responses at the concentration of 10μg/μL, what’s more , the response of female was stronger than male’s. The Y-tube olfactometer bioassays indicated that females  were more sensitive to most volatiles than males. Compare with control, females were attracted by trans-2-hexenol, cis-3- hexanoyl acetate, methyl heptenone and 1-octene-3-alcohol, but males were only attracted by cis-3-hexanoyl acetate. This study could provide a theoretical basis on developing attractants of Anomala corpulenta for ecological management.

Key words: Anomala corpulenta, plant volatiles, Y-tube olfactometer, Electroantennogram, behavioral response

铜绿丽金龟 (Anomala corpulenta Motschulsky) 属鞘翅目，丽金龟子科，是我国地下害虫的优势种之一^[1]。成虫取食榆树、杨树、柳树、葡萄、月季等花木的叶片，危害林果木生长；幼虫俗称蛴螬，为害农作物根、茎部，造成不同程度的减产^[2-4]。蛴螬长期生活在土壤中，隐蔽性强且分布广，防治难度较大，在实际生产中，主要依赖化学农药进行防治，但容易产生食品和环境安全性问题。因此，采用“幼虫为害，防治成虫”是防治此类地下害虫的有效手段之一^[5]。

植物挥发性物质在昆虫对寄主植物的定向定位、取食、产卵等行为活动中起着重要的作用，这也是昆虫在长期进化中对环境逐渐适应的结果^[6-7]。例如：十字花科植物释放的挥发物芥子油对小菜蛾（Plutella xylostella Linnaeus）取食、产卵有引诱作用^[8-9]；鞘翅目中为害松树的天牛科、小蠹虫科及郭公甲科的甲虫对松针中单萜成分α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、莰烯和蒈烯有趋向性^[10]；许多叶甲科昆虫利用寄主植物的挥发物作为嗅觉信号，协同其他信号搜寻和定位寄主^[11]。昆虫利用植物气味的化学指纹图谱进行特异性识别，是搜寻寄主植物的重要信号。

国内外有关金龟子类引诱剂的相关研究也有报道。Imai等发现寄主植物蔷薇（Rosa spp.）花中主要挥发物成分2-苯乙酯对黄绿单爪鳃金龟（Hoplia communis Waterhouse）的引诱作用最强^[12]。欧洲庭园丽金龟（Phyllopertha horticola Linnaeus）对花的挥发物成分顺-3-己烯醇、丁子香酚、香叶醇和邻氨基苯甲酸甲酯敏感^[13]。药用蒲公英（Taraxacum officinale Weber）挥发物中的顺-3-己酰乙酸酯、苯甲醛、苯乙醛、苯甲醇、苯乙醇、苯乙睛、苯甲酸苄酯对扁绿异丽金龟（Anomala octiescostata Burmeister）具有明显引诱作用，与性诱剂结合使用可提高对雄虫的诱捕量^[14]。丙酸苯乙酯 丁子香酚 香叶醇( 3: 7: 3)中加入性信息素Japonilure [（R, Z）-5-葵烯基2（3H）呋喃酮]，这种复合物对日本丽金龟（Popillia japonica Newman）的引诱作用明显提高，已用来田间监测并商业化出售^[15]。李为争等发现铜绿丽金龟成虫对蓖麻表现出明显的趋性，但是这种趋向的目的并不是取食，之后对蓖麻源引诱剂进行了配方筛选和田间效果评价^[16-17]。本研究参考相关研究，选取已有文献报道的寄主挥发物成分和对金龟甲类有引诱作用的化合物，通过触角电位及行为分析，筛选出有效化合物，为开发田间引诱剂提供理论依据。

1  材料与方法

1.1试验材料

1.1.1  供试昆虫

供试铜绿丽金龟雌、雄成虫于2012年6月采自合肥市肥西县董岗乡，采集后将其分别饲养于塑料盒内(60 cm×50 cm×40 cm）中，盒顶罩纱网，盒底铺约20 cm厚的潮湿细土（过20目筛），土壤含水量为18％~20％，饲喂新鲜枫杨树叶，在室内条件下（25℃）饲养。每次试验选择健康成虫进行触角电位和行为测试。

1.1.2 供试药剂及其配制

气味化合物标准品信息如表1，以色谱级正己烷为溶剂，将表中气味物质配制为10μg/μL的正己烷溶液，待用。

                                                                                                     表1  供试化合物的名称、CAS号、纯度及来源

                                                                                                                                                                                                         Table 1  Source, purity, CAS and name of test compounds

1.2试验方法

1.2.1触角电位测定

触角处理方法参照邓思思等^[18]的略加改动，使用PRG-2型金属电极替代玻璃电极连接铜绿丽金龟的触角。取健康活泼的铜绿丽金龟成虫，用小镊子捏住触角基部至鳃片张开，快速拔下触角，用刀片切除基部2~3 mm后，利用导电胶粘于电极上。

所用昆虫触角电位图仪（Syntech）由刺激气体控制装置CS-55、显微操作台MP-15、双通道USB接口采集控制器IDAC-2和显示输出装置组成。测定时取待测溶液10μL均匀滴加于长形滤纸条（4 mm×50 mm），纵向对折后放入进样管中。每个样品雌、雄虫各测试6个触角，每个触角测试3次，试验以反-2-己烯醛的 EAG 反应值作为参照，以正己烷溶液作为对照。持续气流和刺激气流均为500 mL/min，刺激时间为0.5 s，两次刺激间隔时间不少于1 min。

1.2.2 嗅觉反应测定

选取EAG反应相对值较大的10种化合物进行Y型嗅觉仪测定。自制Y型嗅觉仪内径4 cm,主臂长40 cm，两测臂长均为30 cm，两者夹角为60°。载气由大气采样仪泵入，流量设为500 mL/min，空气经过活性炭过滤和空气加湿后进入Y型管，各部件之间用硅胶管连接。Y型管两臂分别与放有样品（10μg/μL）和对照正己烷滤纸条的样品瓶连接。试验测定在室温25℃左右，金龟子活动期20:00以后进行。整个试验保持黑暗环境，并使用红色光源观察以避免光对金龟子活动的干扰。将铜绿丽金龟成虫放在主臂入口，使其头部朝向两侧臂，观察成虫的选择反应。若金龟子在5 min内沿主臂进入任一侧臂内超过5 cm，并停留30 s以上，则视为有选择；若停留在主臂则视为无反应。每种挥发物测试10头成虫，重复6次。每一次测试完后交换左右臂位置，测试完2头更换滤纸条，测试完一组更换Y型管。Y型管及时用丙酮和蒸馏水冲洗，并烘干。

1.3  数据处理

供试化合物的触角电位反应相对值参照，具体如下：

S_r=×100%

式中:S_r为刺激样品的触角电位反应的相对值; S_c为刺激样品的触角电位反应值; CK_m为刺激样品测定前后正己烷对触角电位的反应值的平均值; R_m为测定刺激样品触角电位前后参照的标准化合物触角电位的平均值。

所有数据统计分析均利用SPSS 17.0进行处理。EAG反应的相对值采用Duncan’s多重比较法进行差异显著性比较，雌、雄成虫对同一化合物的EAG反应差异检验用t测验；铜绿丽金龟在嗅觉反应中对测试气体及空白对照间的选择性差异分析采用卡方检验。

2.结果与分析

2.1铜绿丽金龟对挥发物的EAG反应

铜绿丽金龟对供试挥发物的EAG反应相对值及显著性分析见表2。从总的测定结果来看，引起铜绿丽金龟EAG反应相对值较大的挥发物依次为：甲基庚烯酮（213.62%）、顺-3-己酰乙酸酯（210.21%）、壬醛（179.75%）、1-辛烯-3-醇（164.12%）、芳樟醇（162.07%）和反-2-己烯醇（153.78%）。表中EAG反应相对值低于100%表示该挥发物的EAG反应值低于参照化合物反-2-己烯醛。α-蒎烯对铜绿丽金龟的EAG反应值最小，反应相对值仅为9.72%，其的EAG反应值仅与对照正己烷相当。

表2 铜绿丽金龟对挥发物的EAG反应相对值

Table 2  Relative EAG value of Anomala corpulenta to volatiles

                                                                                                  注：表中小写字母不同代表同一列数据之间的差异显著（P＜0.05）。

                                                                                                                                                                                                    Note: The date with different lowercase letters indicate significant difference in the same column (P＜0.05)

通过铜绿丽金龟雌、雄成虫对各气味物质EAG数据的对比可以看出，铜绿丽金龟雌虫对大部分供试气味物质的EAG反应相对值略高于雄虫。如图1所示，在试验测定的20种挥发物中，铜绿丽金龟雌、雄虫对14种挥发物的EAG反应相对值存在显著性差异，其中雌虫对11种挥发物的EAG反应相对值大于雄虫。雌虫对反-2-己烯醇、芳樟醇、甲基庚烯酮的反应相对值较大，均在200%以上；而引起雄虫反应相对值较大的挥发物依次为顺-3-己酰乙酸酯、甲基庚烯酮、1-辛烯-3-醇。从图中可以看出，反-2-己烯醇、芳樟醇、2-乙基己醇在雌、雄虫间的差异较为显著，其雌、雄虫的EAG反应相对值比值约为18:1、11:1、3:1。

1.反-2-己烯醇 E-2-hexenol；2.芳樟醇 Linalool；3.香叶醇 Geraniol；4.丁子香酚 Eugenol；5.柠檬烯Dipentene；6.α-蒎烯 α-pinene；7.顺-2-己烯醇Z-2-hexenol；8.甲基庚烯酮 6-methyl-5-hepten-2-one；9.壬醛 Nononal；10.顺-3-己酰乙酸酯 Z-3- hexanoyl acetate；11.辛醛 Octanal；12.苯乙醇 Phenethyl alcohol；13.α-松油醇 α-trepineol；14.1-辛烯-3-醇 1-octene-3-alcohol；15. 庚醛 Heptaldehyde；16. 2-乙基己醇 2-ethylhexanol；17. 顺-3-己烯醇Z-3-hexenol；18. 邻氨基苯甲酸甲酯 Methyl anthranilate；19. 香叶醇 Geraniol；20. 丙酸苯乙酯 2-phenethyl propionate。

图1 铜绿丽金龟雌、雄虫对挥发物的EAG反应相对值

Fig. 1 Relative EAG value of Anomala corpulenta to volatiles

注：图中“﹡”为该气味物质引起雌雄铜绿丽金龟EAG反应相对值的t检验达显著差异（P＜0.05）。

Note: ‘﹡’means significant difference (P＜0.05) between female and male Anomala corpulenta to plant volatiles

2.2铜绿丽金龟对挥发物的选择反应测定

综合比较铜绿丽金龟雌、雄虫对10种挥发物的选择反应，发现雌虫对多数挥发物的敏感度高于雄虫。从图中可以看出，反-2-己烯醇、顺-3-己酰乙酸酯对铜绿丽金龟雌虫的吸引作用高于对照，且差异极显著；甲基庚烯酮、1-辛烯-3-醇对雌虫也有显著的吸引作用，但对辛醛、庚醛的趋向性显著低于对照；而雄虫仅对顺-3-己酰乙酸酯有显著的趋向选择，对其他9种挥发物没有显著的趋向选择性。

图2 铜绿丽金龟对10种气味物质的行为反应

Fig 2 Behavioral responses of Anomala corpulenta to ten plant volatiles

注：图中柱长代表铜绿丽金龟雌、雄虫选择供试化合物或对照的数量。“♂”、“♀”分别代表雄、雌虫对该化合物的选择作用。“*”表示卡方检验达显著差异（P＜0.05），“**”为极显著差异（P＜0.01）

Note: The length of columns indicate the number of Anomala corpulenta attracted by the test compounds or the control. ‘♂’,‘♀’represent the number of male and female respectively. ‘﹡’ means significant difference (P＜0.05) by chi-square test, ‘**’means extremely difference (P＜0.01).

3 讨论

植物挥发物中含有数十种甚至上百种的化学物质，然而这其中只有一小部分关键化合物对昆虫的行为起决定性作用^[19]。邓思思等研究发现华北大黑鳃金龟对顺-2-己烯醇、反-2-己烯醇、顺-3-己酰乙酸酯、辛醛和苯乙醇有较强的电位反应^[18]。苹毛丽金龟对顺-3-己烯醇、香叶醇、茴香脑和丁香酚有明确的EAG反应和行为反应^[20]，而本研究中铜绿丽金龟对甲基庚烯酮、顺-3-己酰乙酸酯、壬醛、1-辛烯-3-醇、芳樟醇和反-2-己烯醇具有较强的触角电位反应，对试验中其他挥发物反应一般，但对α-蒎烯的反应和华北大黑鳃金龟一致，都为最小值，仅与对照相当。这说明不同金龟子对气味的选择性有相似点，但也存在种间差异。

不同性别的昆虫在寻找寄主、繁殖后代等行为中所起的作用不同，反映出雌、雄成虫的触角感受器可能存在与性别有关的数量上、分布上的差异或存在嗅觉生理方面的差异，导致其对气体的敏感性存在性别差异^[21-22]。铜绿丽金龟成虫触角感受器的超微结构观察也显示，雌雄间感受器种类无明显差别，但在分布和数量上有差异^[23]。本研究中，铜绿丽金龟雌虫对大多数植物源挥发物的敏感度高于雄虫，这与前人的研究结果一致^[18,24]。陈展册等人发现绿盲蝽雌虫对植物挥发物更敏感，而雄虫对性信息素类似物比雌虫更敏感^[25]。这可能与雌虫在繁殖后代过程中需要大量取食补充营养，以及寻找合适的产卵地有关。

反-2-己烯醇是常见的“绿叶气体”，也是植物挥发物的常见组分，对多种昆虫均有较强的引诱作用^[18,25-26]。嗅觉行为测定中，反-2-己烯醇对铜绿丽金龟雌虫也有明显的吸引作用，但对雄虫的引诱作用不显著，这可能与雌、雄虫的取食特性相关。Dickens认为最常见的绿叶气味物质1-己醇、反-2-己烯醇、顺-3-己烯醇及其衍生物对昆虫信息素具有广泛的增效作用^[27]。因而，进一步研究信息素和植物源引诱剂互作可以提高防治的综合效果^[14]。顺-3-己酰乙酸酯对华北大黑鳃金龟也有较强的引诱作用^[18]，茶尺蠖绒茧蜂对其也有较强的EAG反应^[28]。在本试验中，顺-3-己酰乙酸酯对铜绿丽金龟雌、雄虫均有较显著的室内引诱效果，但还需要进一步的田间试验验证。铜绿丽金龟对蓖麻中含有的芳樟醇、α-松油醇未见明显的趋向行为^[29]。

植物源挥发物和性信息素在铜绿丽金龟成虫寻找寄主、求偶、产卵过程中具有综合作用^[30]。性别差异、是否交配、营养需求度等都决定昆虫对气味的趋向行为。雄虫通过感受雌虫释放的性信息素对雌虫进行定位并搜索寻找，以期获得优先交配权；雌虫繁衍后代的使命使其对植物挥发物较为敏感^[25]。试验中也发现，铜绿丽金龟雌虫在产卵期对气味敏感度增加，晚上活动期比雄虫活跃。本试验筛选出对铜绿丽金龟成虫具有引诱作用的挥发物，为开发田间引诱剂提供理论依据，但是铜绿丽金龟成虫在交配、产卵前后对气味的趋向选择性、引诱剂的田间实际应用、引诱剂与性信息素互作关系等方面有待进一步的研究。

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